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一文全面解读困扰你的260/280、260/230

作者:上海魔兜儿生物科技有限公司 2025-07-11T00:00 (访问量:515)

什么是“260/230”、“260/280”?

在“PCR”、“qPCR”、“逆转录”、“一代测序”、“RNA-seq”等核酸下游实验中,似乎每一个进行过这些实验的实验人员对“260/230比值”“260/280比值”都有一定的概念。但不同科研者对此似乎有不同的解读方法,每个实验室可能都有一套流传已久、自圆其说的比值范围要求。

“1.8-2.0是比较好的,2.1有点偏高,有优化的建议吗?”

“有客户反应两个吸光度比值偏高,达到2.1。” 

“对于RNA浓度测定,那260/280的差异一般在哪里?”

基于以上疑惑,我们先来看看试剂厂家们是怎么说的。

表1. 不同试剂厂家对比值解读

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Thermo: It is important to note that the generally accepted 260/280 ratios of1.8 and 2.0 for DNA and RNA respectively, are "rules of thumb". The actual ratio will depend on the composition of the nucleic acid. The 260/230 values for “pure” nucleic acid are often higher than the respective 260/280 values. Expected 260/230 values are commonly in the range of 2.0-2.2.

NEB: In buffered solutions, pure dsDNA has an A260/A280 of 1.85–1.88 and pure RNA has a ratio of around 2.1. In buffered solutions, pure dsDNA has slightly higher A260/A230 ratios than RNA, with a value of 2.3–2.4 commonly reported for dsDNA and 2.1–2.3 for RNA. A260/A230 ratios typically produce a higher standard deviation than A260/A280 ratios and should be interpreted with care.

Qiagen: An A260/A280 ratio of 1.8–2.1 at pH 7.5 is widely accepted as indicative of highly pure RNA. Pure RNA should also yield an A260/A230 ratio of around 2 or slightly higher; however, there is no consensus on the acceptable lower limit of this ratio.

由上得知,不同试剂厂家对于比值的要求也不尽相同,都是略有差别。要解决如上问题,我们还得从源头看看260/230”、“260/280”到底意味着什么。

在“朗伯-比尔定律(Beer-Lambert law)”公式中,提出了吸光度值(absorbance,简写A)的概念,为了便于回忆,呈上公式:A=lg(1/T)=Kbc。

该公式是对下面客观事实的总结:某一化学物质可吸收一定波长的光,并且对光的吸收度(A)与此化学物质的浓度(c)成正比因此,可以利用吸光度的大小来测定某种物质的浓度

某一物质在某一个特定波长下的吸光度可用An来表示。

现在我们都知道了,A260代表核酸在最高吸收峰260nm波长处的吸光度值,即260nm处的核酸最易“表现”自己,通过检测260nm处吸收的吸光度值最可评测纯化双链DNA、单链DNA或RNA样品的浓度(见图2)。

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图2. 核酸吸光度谱

也可以看出核酸在220-300nm光谱范围内均可产生吸光度值,因此,核酸也有其对应的A230、A240、A280值等。

与A260类似,蛋白及其他物质各有各的吸收峰,裂解液、结合液、漂洗液、洗涤液和洗脱液中会有TRIzol、硫氰酸胍、盐酸胍等离液盐、SDS、Triton X-100、Tween 20等去污剂、苯酚、EDTA、乙醇、异丙醇、NaCl等物质。

A280最能反映蛋白质浓度(蛋白有多个吸收峰,A280用的较多),A230最能反映乙醇、GTC、GuHCl等的含量,A270可用于苯酚浓度。

人们发现:“pure”DNA/RNA的吸光度值是可测量的,且“A260/ A280、A260/ A230比值”具有规律(见后续比值数据)。因此,约定俗成地认为,比值在一定程度上可说明DNA、RNA的纯度。测比值属于核酸质量评估最简单快速、经济实惠的方法之一。

A260/ A280与A260/ A230的合理范围

1、撇开浓度去谈比值,纯属耍流氓

作为非利益方,美国NEB官方做过这样的一个测试:“a dilution series DNA of 150ng/µl down to 1ng/µl in TE buffer was analyzed to measure concentration and purity ratios”,评估NanoDrop® One(这台仪器是Thermo家的)测定A260/ A280与A260/ A230的准确性。

最终得出结论:当低于50ng/µl,A260/ A280、A260/ A230比值波动非常大,应谨慎对待!当高于50ng/µl,比值波动小,测定值可信赖!

表2A. 不同浓度DNA A260/ A280比值

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表2B. 不同浓度DNA A260/ A230比值

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2、要特别注意的提取污染物

考虑提取DNA、RNA时,洗脱液中或多或少会有提取试剂或样本蛋白等的残留物,这些物质在220-300nm光谱处可形成吸光度谱,可能会与核酸吸光度谱叠加或不明趋势地形成组合吸光度谱。这造成最终DNA/RNA测定的吸光度不能真实反应比值。

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图3. 1M异硫氰酸胍盐测定的浓度值及其A260/A280和A260/A230比值(注:异硫氰酸胍是TRIzol的主要成分)

有文献报告,选择性地掺入25-200mg/ml蛋白样品到高、低浓度(25ng/µl和100ng/µl)DNA中,蛋白污染对于低浓度DNA的比值测定值影响极大。(见表3)

表3. 蛋白质污染程度对DNA比值测定的影响

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3、DNA和RNA的比值

DNA中污染RNA或RNA中污染DNA,都会引起比值的偏差。这是因为,组成DNA和RNA的A/T/C/G/U 5种核苷酸本身的A260/ A280比值不均一,而紫外吸光图谱缺乏特异性,无法有效区分DNA和RNA。所以,高AT含量和高GC含量的核酸比值可能也会有偏差。

注1:5种核苷酸溶液A260/ A280比值:G,1.15;A,4.5;C,1.51; T,1.47; U,4.00。

注2:一般认为,DNA中污染15-20%的总RNA,会造成A260/ A280升高——由1.8偏移到1.9,A260/ A230则会下降。

4、pH及盐离子的影响

A=lg(1/T)=Kbc中明确了在一定离子浓度与pH值的溶液中测吸光度值,这说明两者会影响吸光度值。因此,洗脱缓冲液的选择非常重要。

酸性溶液或水溶液比弱碱性缓冲液(如Tris缓冲液,pH8.0)的A260/ A280值低0.3-0.4。并且后者测定的A260/ A230值变异度更小。

因此,核酸浓度及质量评估时,应注意核酸稀释液和洗脱液保持一致。

5、核酸完整度的影响

RNA的糖环上比DNA糖环上多一个自由羟基,加上环境中大量的RNA酶,RNA更易出现降解的情况。RNA的完整度不建议用吸光度比值来判断!

关注比值,更应关注下游实验应用

A260/ A280和A260/ A230仅作为样本质量的参考指标,比值在不在标准范围内对下游实验检测或许不那么重要。

Qiagen公司提供了参考数据:

0.1mM硫氰酸胍掺入到RNA中,A260/A230会严重下降,但高达100mM硫氰酸胍掺入到RNA中,不影响后续的反转录及qPCR结果。

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因此,对于核酸的比值问题,我们首先要判断核酸混入其他物质对所要进行的下游实验的影响,如果不影响下游实验,大可以不必那么关注比值问题。

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