什么是“260/230”、“260/280”？

在“PCR”、“qPCR”、“逆转录”、“一代测序”、“RNA-seq”等核酸下游实验中，似乎每一个进行过这些实验的实验人员对“260/230比值”“260/280比值”都有一定的概念。但不同科研者对此似乎有不同的解读方法，每个实验室可能都有一套流传已久、自圆其说的比值范围要求。

“1.8-2.0是比较好的，2.1有点偏高，有优化的建议吗？”

“有客户反应两个吸光度比值偏高，达到2.1。” 

“对于RNA浓度测定，那260/280的差异一般在哪里？”

基于以上疑惑，我们先来看看试剂厂家们是怎么说的。

表1. 不同试剂厂家对比值解读

Thermo: It is important to note that the generally accepted 260/280 ratios of1.8 and 2.0 for DNA and RNA respectively, are "rules of thumb". The actual ratio will depend on the composition of the nucleic acid. The 260/230 values for “pure” nucleic acid are often higher than the respective 260/280 values. Expected 260/230 values are commonly in the range of 2.0-2.2.

NEB: In buffered solutions, pure dsDNA has an A₂₆₀/A₂₈₀ of 1.85–1.88 and pure RNA has a ratio of around 2.1. In buffered solutions, pure dsDNA has slightly higher A₂₆₀/A₂₃₀ ratios than RNA, with a value of 2.3–2.4 commonly reported for dsDNA and 2.1–2.3 for RNA. A₂₆₀/A₂₃₀ ratios typically produce a higher standard deviation than A260/A280 ratios and should be interpreted with care.

Qiagen: An A₂₆₀/A₂₈₀ ratio of 1.8–2.1 at pH 7.5 is widely accepted as indicative of highly pure RNA. Pure RNA should also yield an A₂₆₀/A₂₃₀ ratio of around 2 or slightly higher; however, there is no consensus on the acceptable lower limit of this ratio.

由上得知，不同试剂厂家对于比值的要求也不尽相同，都是略有差别。要解决如上问题，我们还得从源头看看“260/230”、“260/280”到底意味着什么。

在“朗伯-比尔定律（Beer-Lambert law）”公式中，提出了吸光度值（absorbance，简写A）的概念，为了便于回忆，呈上公式：A=lg(1/T)=Kbc。

该公式是对下面客观事实的总结：某一化学物质可吸收一定波长的光，并且对光的吸收度（A）与此化学物质的浓度（c）成正比。因此，可以利用吸光度的大小来测定某种物质的浓度。

某一物质在某一个特定波长下的吸光度可用A_n来表示。

现在我们都知道了，A₂₆₀代表核酸在最高吸收峰260nm波长处的吸光度值，即260nm处的核酸最易“表现”自己，通过检测260nm处吸收的吸光度值最可评测纯化双链DNA、单链DNA或RNA样品的浓度（见图2）。

图2. 核酸吸光度谱

也可以看出核酸在220-300nm光谱范围内均可产生吸光度值，因此，核酸也有其对应的A₂₃₀、A₂₄₀、A₂₈₀值等。

与A₂₆₀类似，蛋白及其他物质各有各的吸收峰，裂解液、结合液、漂洗液、洗涤液和洗脱液中会有TRIzol、硫氰酸胍、盐酸胍等离液盐、SDS、Triton X-100、Tween 20等去污剂、苯酚、EDTA、乙醇、异丙醇、NaCl等物质。

A₂₈₀最能反映蛋白质浓度（蛋白有多个吸收峰，A₂₈₀用的较多），A₂₃₀最能反映乙醇、GTC、GuHCl等的含量，A₂₇₀可用于苯酚浓度。

人们发现：“pure”DNA/RNA的吸光度值是可测量的，且“A₂₆₀/ A₂₈₀、A₂₆₀/ A₂₃₀比值”具有规律（见后续比值数据）。因此，约定俗成地认为，比值在一定程度上可说明DNA、RNA的纯度。测比值属于核酸质量评估最简单快速、经济实惠的方法之一。

A₂₆₀/ A₂₈₀与A₂₆₀/ A₂₃₀的合理范围

1、撇开浓度去谈比值，纯属耍流氓

作为非利益方，美国NEB官方做过这样的一个测试：“a dilution series DNA of 150ng/µl down to 1ng/µl in TE buffer was analyzed to measure concentration and purity ratios”，评估NanoDrop^® One（这台仪器是Thermo家的）测定A₂₆₀/ A₂₈₀与A₂₆₀/ A₂₃₀的准确性。

最终得出结论：当低于50ng/µl，A₂₆₀/ A₂₈₀、A₂₆₀/ A₂₃₀比值波动非常大，应谨慎对待！当高于50ng/µl，比值波动小，测定值可信赖！

表2A. 不同浓度DNA A₂₆₀/ A₂₈₀比值

表2B. 不同浓度DNA A₂₆₀/ A₂₃₀比值

2、要特别注意的提取污染物

考虑提取DNA、RNA时，洗脱液中或多或少会有提取试剂或样本蛋白等的残留物，这些物质在220-300nm光谱处可形成吸光度谱，可能会与核酸吸光度谱叠加或不明趋势地形成组合吸光度谱。这造成最终DNA/RNA测定的吸光度不能真实反应比值。

图3. 1M异硫氰酸胍盐测定的浓度值及其A₂₆₀/A₂₈₀和A₂₆₀/A₂₃₀比值（注：异硫氰酸胍是TRIzol的主要成分）

有文献报告，选择性地掺入25-200mg/ml蛋白样品到高、低浓度（25ng/µl和100ng/µl）DNA中，蛋白污染对于低浓度DNA的比值测定值影响极大。（见表3）

表3. 蛋白质污染程度对DNA比值测定的影响

3、DNA和RNA的比值

DNA中污染RNA或RNA中污染DNA，都会引起比值的偏差。这是因为，组成DNA和RNA的A/T/C/G/U 5种核苷酸本身的A₂₆₀/ A₂₈₀比值不均一，而紫外吸光图谱缺乏特异性，无法有效区分DNA和RNA。所以，高AT含量和高GC含量的核酸比值可能也会有偏差。

注1：5种核苷酸溶液A₂₆₀/ A₂₈₀比值：G，1.15；A，4.5；C，1.51; T，1.47; U，4.00。

注2：一般认为，DNA中污染15-20%的总RNA，会造成A₂₆₀/ A₂₈₀升高——由1.8偏移到1.9，A₂₆₀/ A₂₃₀则会下降。

4、pH及盐离子的影响

A=lg(1/T)=Kbc中明确了在一定离子浓度与pH值的溶液中测吸光度值，这说明两者会影响吸光度值。因此，洗脱缓冲液的选择非常重要。

酸性溶液或水溶液比弱碱性缓冲液（如Tris缓冲液，pH8.0）的A₂₆₀/ A₂₈₀值低0.3-0.4。并且后者测定的A₂₆₀/ A₂₃₀值变异度更小。

因此，核酸浓度及质量评估时，应注意核酸稀释液和洗脱液保持一致。

5、核酸完整度的影响

RNA的糖环上比DNA糖环上多一个自由羟基，加上环境中大量的RNA酶，RNA更易出现降解的情况。RNA的完整度不建议用吸光度比值来判断！

关注比值，更应关注下游实验应用

A₂₆₀/ A₂₈₀和A₂₆₀/ A₂₃₀仅作为样本质量的参考指标，比值在不在标准范围内对下游实验检测或许不那么重要。

Qiagen公司提供了参考数据：

0.1mM硫氰酸胍掺入到RNA中，A₂₆₀/A₂₃₀会严重下降，但高达100mM硫氰酸胍掺入到RNA中，不影响后续的反转录及qPCR结果。

因此，对于核酸的比值问题，我们首先要判断核酸混入其他物质对所要进行的下游实验的影响，如果不影响下游实验，大可以不必那么关注比值问题。